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重组酶聚合酶扩增技术及其在植物病原检测中的应用

发布时间:2020年03月28日 16:07  浏览次数:

开展病原物鉴定是植物病害早期诊断、检疫、监测和病害防治等工作的重要基础。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)核酸扩增技术由于具有灵敏、准确等优点,成为植物病原分子鉴定的重要手段。随着分子生物学的不断发展,不依赖温度循环系统的等温扩增技术应运而生。等温扩增技术在单一温度条件下进行,对仪器依赖性低,反应快速,非常适合现场快速检测,逐渐受到广泛关注。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是目前最接近于常温扩增的技术。

RPA技术通过模拟细胞体内DNA复制过程,实现核酸体外扩增。整个反应体系重点依赖于3种重组酶,即重组酶uvsX、单链结合蛋白gp32和链置换DNA聚合酶Bsu,以及一种辅助蛋白uvsY;其中,uvsX和uvsY由T4 噬菌体编码。RPA的优势在于:①3种重组酶的混合物在常温下也有活性,可在37~ 42℃等温条件下进行反应,不需要常规PCR的高温变性和高温扩增过程;②对检测样品的前处理要求也不及PCR高;③整个RPA反应在5-20min即获得可检出水平的扩增产物,远快于PCR和其它等温扩增技术。基于RPA扩增技术的产物检测方法主要有凝胶电泳,实时荧光及测流试纸条检测等。后两种检测方法操作简单,不需要专业昂贵的仪器,甚至肉眼就可以读取结果,是适用于现场快速检测的理想方法。

RPA技术因其具有快速、灵敏、简便等特点,目前在医学病原快速检测已有了较多的应用,农业领域多集中在食品安全、转基因作物检测等方面。随着该项技术的应用和推广,近几年也逐渐地应用于植物病原检测。植物病毒作为植物重要病原之一,精准检测与诊断是有效管理该类病害的重要环节,植物苗木种植和运输之前,利用快速灵敏的方法检测其带毒情况,对于控制植物病毒传播至关重要。而RPA技术给植物病毒的快速诊断带来了新的选择,目前已有一些RPA在植物病毒检测中应用的报道。

作为一项新技术,RPA也存在一些难点:①引物和探针的设计和筛选,要求比较高,并且没有现成的软件辅助设计;②有些情况下产物需要纯化或稀释后进行检测;③样品简化处理与检测灵敏度需进一步兼顾。尽管存在以上不足,RPA仍不失为一种最具希望的、在快速检测中替代PCR的核酸检测技术。随着RPA技术的不断应用和进一步探索,它将在更多的领域体现应用价值,尤其在农作物病害田间早期诊断、种子病害以及贮藏期病害快速检测等方面崭露头角,为植物病害的综合治理起到积极的作用。

RPA循环(PiepenburgO et al, 2006)

(作者简介:周莹,副研究员,主要从事果蔬病害的诊断鉴定、病害发生规律与防控技术研究。)

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